2019年10月（yuè）1日，5-羟甲（jiǎ）基化胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在（zài）糖尿病研究领域取（qǔ）得重要进（jìn）展。2型糖尿病（bìng）（T2D）的（de）血管并发症是（shì）导致（zhì）2型糖尿病致残致死的（de）重（chóng）要（yào）病（bìng）因，一直缺乏一种无创便捷的临（lín）床途径实现血管并（bìng）发症的（de）发（fā）生发展监测，达到早发现、早干预，以提高T2D病人（rén）的整体生活质（zhì）量，减少卫生经济（jì）负担。

该研究入（rù）组了62例2型糖尿病病人，采（cǎi）用5hmC-Seal技术对血浆（jiāng）cfDNA中表观遗传标志物5hmC的分布情况进行检测，分（fèn）析5hmC标志物（wù）与2型糖尿（niào）病血管（guǎn）并发症（zhèng）发生发（fā）展（zhǎn）的相关性。结果（guǒ）表（biǎo）明5hmC标志物的（de）变化与T2D合并大（dà）血管/微血（xuè）管事件具有相关性，主要涉及一些与血管生物学和糖尿病（包括胰岛素耐受（shòu）和炎症反（fǎn）应）相关的基因和信号通路。该研究建（jiàn）立的16个（gè）基因-5hmC标志物（wù）组合检（jiǎn）测可以准确区分有并发症和无并发症的（de）2型糖尿病（bìng）病人[实验组（zǔ）：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明显优于（yú）传统临床变量例如白蛋白（bái）尿。除此之（zhī）外，还建（jiàn）立（lì）了13个基因（yīn）-5hmC标志物组合检测，可以进一步区分T2D合并单一并（bìng）发症和多种并发症（zhèng）[实验组：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同样明显优于（yú）其（qí）他传（chuán）统临（lín）床变量。该研究（jiū）得（dé）出结（jié）论，5hmC标志物反（fǎn）映了T2D病人大血管/微血管（guǎn）并发症发（fā）生过程中的表观遗传变（biàn）化，因而5hmC-Seal检测技（jì）术在（zài）监测糖尿病（bìng）血管并发症发生（shēng）和进展方面具有良好的临床应（yīng）用前景。

本研究共纳（nà）入62例2型糖尿病病人，包（bāo）括没有血管并（bìng）发（fā）症的病人12例，有单一血管并（bìng）发症的（de）病人34例（24例（lì）发（fā）生大（dà）血管事件，10例发生微（wēi）血管（guǎn）事件），以及有多种血管（guǎn）并发症的病人16例。试（shì）验收集（jí）62例病人血浆，提取cfDNA，利用5hmC-Seal技术捕获外周血cfDNA中的5hmC序列，进行（háng）二代测（cè）序，通过生物信息学分（fèn）析（xī）找出并发症组与无并发（fā）症组之间有显著5hmC修（xiū）饰差异的基因，单一（yī）并发症组和（hé）多种并发症组之间有显著（zhe）5hmC修（xiū）饰差异的（de）基因。随后利用（yòng）回归模型对差异基因进一步（bù）筛选、优化（huà），弹性（xìng）网络进（jìn）一（yī）步筛选，计算加（jiā）权平均分，最后得到（dào）一组具有高度（dù）灵（líng）敏度（dù）和特异性（xìng）的5hmC生物标（biāo）记（jì）物，并进一步在实验组中验（yàn）证（zhèng），分析（xī）其灵敏（mǐn）度和特（tè）异（yì）性。并将新建立的5hmC标志物基因组合的检测性能与传统临床变量（liàng）进行对比分（fèn）析。最（zuì）后对（duì）相关基因进（jìn）行了信（xìn）号通路分（fèn）析和功能（néng）探究。

5hmC修饰水平与血管并发症具有相关性

利用逻辑回归（guī）模型对62例有并发症和无并（bìng）发（fā）症（zhèng）2型糖尿病（bìng）病人的（de）5hmC差异水平进（jìn）行分析发（fā）现，有并发症（zhèng）2型糖尿病病人（rén）的622个差异修（xiū）饰（shì）候（hòu）选基因（包括上调和下（xià）调基因）的（de）归一化平均（jun1）数要明（míng）显高于无并发（fā）症的病人（P<0.001），但是单一并发症和（hé）多发并发（fā）症病人之间没有显著差异。

之后将（jiāng）有单一（yī）并发（fā）症或多种并发症（zhèng）的（de）50例病人用（yòng）逻辑回归模型（xíng）进行了对比，发现多种（zhǒng）并发症的（de）病人的153个（gè）差（chà）异修饰候选基因（包括上调（diào）和下（xià）调基（jī）因）的（de）归一（yī）化平均数要低（dī）于无并发症病人（P<0.001）。

5hmC标志物可区分有无（wú）并发症患者

62例2型糖尿病病人被随机分成（chéng）训练组（n=31）和（hé）测试组（n=31）。利用（yòng）弹性网络筛选后发现，16基因-5hmC标志物组合检测（cè）可以用于区分有并发（fā）症和无并发症的2型糖尿病病人。

基于16基因组合（hé）模型（xíng） (Detection Model 1) 的加权平均分分（fèn）析（xī），发现无并（bìng）发症病人的（de）分数（shù）在（zài）训练集和测试（shì）集中都明显低（dī）于有并（bìng）发症的（de）病人。只考虑加权平均分的话，受试（shì）者工作特（tè）征曲线（ROC）分（fèn）析表（biǎo）明将cutoff值（zhí）设置成（chéng）0.5时，在测试组中中的灵（líng）敏度为（wéi）60%，特异（yì）性为（wéi）100%。

5hmC标（biāo）志物可区分病（bìng）人（rén）是单一并发症还是多种并发症

50例有并发（fā）症的2型糖尿病病人被随机分成（chéng）训练组（n=25）和测试组（n=25）。利（lì）用弹性网络筛选后发现，13基因-5hmC标（biāo）志物组合可以区分2型糖尿病病（bìng）人是否发生单一（yī）并发（fā）症或多种并（bìng）发（fā）症。

基于（yú）13基因组合模型 (Detection Model 2)， 我们计算了单一并发症和多种并发症的加权平均分，发现在训练集和测试集（jí）中单（dān）一并发症和多种并（bìng）发（fā）症病（bìng）人的分数都有明显差异。值得一提（tí）的是，有（yǒu）肾病（bìng）并发（fā）症（zhèng）和无肾病并发症（zhèng）病人（rén）的分数也有明（míng）显差异。利用加权平均（jun1）分作为判（pàn）断标（biāo）准（zhǔn）的受试者工作特征曲线（ROC）表明，在测试组中当（dāng）将cutoff值设成0.69时，灵敏度为87.5%，特异（yì）性为（wéi）68.8%。

5hmC标志物（wù）与传统临（lín）床变量/危险（xiǎn）因子的对（duì）比（bǐ）

我们评估了不同临床（chuáng）变量（liàng）/危（wēi）险（xiǎn）因子用于监（jiān）测血管（guǎn）并发症的灵敏度和（hé）特异性（见表1）。

信号通路分析和功能探（tàn）究

有并发（fā）症和无（wú）并发症（zhèng）病（bìng）人的135个差（chà）异（yì）候选基因的功能注释分析表（biǎo）明，这些基因主要富（fù）集在一些经典的信号通路（lù）。错误（wù）发现率相关（guān）P值位于前10%和基因数目≥3的信号通路包括（kuò）由IGF1R, IL-10和（hé）FGFR2所介导的信号通路（lù）。由IGF1R和（hé）IL-10介导的信号通路（lù）与胰岛素抵（dǐ）抗（kàng）及炎症（zhèng）反应相关，在血管生物学和糖（táng）尿（niào）病（bìng）发生发展（zhǎn）过程中（zhōng）发挥重要作用（yòng）。

Reactome相互作用网络（luò）的中心（xīn）表明，泛素（sù）编码（mǎ）基因[泛（fàn）素B (UBB)，泛素C (UBC)，泛（fàn）素A-52亚基核糖体蛋白融合产物（wù）1(UBA52)]是候（hòu）选基因（如SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和TBCC）的重要（yào）连接者。在这135个差异候选基因中, 一些基因 （如TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表现出与糖尿病病程相关（guān）的（de）倾向，表明5hmC和糖（táng）尿病（bìng）血管并发症之间可能存在时间依赖性的相互作用。基于纵向（xiàng）时间队列的大样本研究，将可进一（yī）步明确5hmC变化（huà）和糖尿（niào）病持续时间之间的动态关联（lián）。关（guān）于单一并发症和多种（zhǒng）并发症（zhèng）病人的159个候选标志基因（yīn）的功能（néng）注（zhù）释研（yán）究发现，存在细胞-细胞连接、胶原蛋白形成（chéng）、新陈代谢（xiè）、细胞应激应答信号通路（lù）的富集，这（zhè）些信号（hào）通（tōng）路均与（yǔ）细（xì）胞基（jī）本功能（néng）密切相关。

血管并发症是三（sān）分之二糖尿（niào）病病人的死（sǐ）亡（wáng）原因，若能及早有效（xiào）控制血管并发症的发（fā）生，将极大地改善糖（táng）尿（niào）病病人的生（shēng）存质量。该研究建立了一种（zhǒng）利用（yòng）cfDNA进行2型糖尿病血（xuè）管（guǎn）并发症（zhèng）监测的无创便捷方法，较目前临床标志物能（néng）更准确地监控血管并发症的发生，从（cóng）而提示临床及（jí）早采取应对措施，有效（xiào）控（kòng）制病情（qíng）进展。